台湾地区制定食品中色素检验方法，2012年11月19日生效2012年11月19日，台湾地区“行政院”卫生署发布署授食字第1011903531号公告，制定“食品中着色剂之检验方法”，自即日生效。
食品中着色剂之检验方法
1.  适用范围：本检验方法适用于食品中着色剂之检验。
2.  检验方法：检体经萃取及毛线染色后，以滤纸层析（paper chromatograph, PC）、薄层层析（thin layer chromatograph, TLC）及高效液相层析仪（high performance liquid chromatograph, HPLC）分析之方法。
2.1. 检体之调制：
2.1.1. 试药：乙醇、醋酸、乙醚、石油醚、氨水（25%）及氯化钠均采用试药级；去离子水（比电阻于 25℃ 可达 18 M W‧cm以上）。
2.1.2. 试剂之调制：
2.1.2.1. 80%乙醇溶液：
       　    取乙醇与去离子水，以80：20（v/v）之比例混匀。
2.1.2.2. 70%乙醇溶液：
       　　取乙醇与去离子水，以70：30（v/v）之比例混匀。
2.1.2.3. 含1%氨水之70%乙醇溶液：
       　　取氨水4 mL，加70%乙醇溶液使成100 mL。
2.1.2.4. 含1%醋酸之70%乙醇溶液：
       　　取醋酸1 mL，加70%乙醇溶液使成100 mL。
2.1.2.5. 10%氨水溶液：
       　　取氨水40 mL，加去离子水使成100 mL。
2.1.2.6. 25%氯化钠溶液：
       　　称取氯化钠 25 g ，加去离子水溶解使成100 mL。
2.1.2.7. 6%醋酸溶液：
       　　取醋酸6 mL，加去离子水使成100 mL。
2.1.3. 试验溶液之调制：
2.1.3.1. 液状检体（酒精饮料、清凉饮料及液状调味品等）：
       　　     依着色程度称取检体20～200 mL，加适量去离子水作为试验溶液，检体含乙醇者，先中和呈中性后，置于水浴上去除乙醇，再加去离子水至原容量作为试验溶液。
2.1.3.2. 糖果、糕饼及农产品：
       　　依着色程度称取检体20〜 200 g ，研碎或切碎，按下列方法制成试验溶液。
2.1.3.2.1.    糖果等制品：
         　　 检体加入约5倍量之热去离子水，溶解后作为试验溶液，检体仅表面着色时，取着色部分调制之。
2.1.3.2.2.    腌渍蔬果类：
         　　      检体加入约4〜5倍量之80%乙醇溶液，振摇混合，放置2〜3小时后，取浸出液，检体再以含1%氨水之70%乙醇溶液一次或数次反复浸出，合并浸出液，以6%醋酸溶液中和。置于水浴上去除大部分乙醇，再加去离子水至原容量作为试验溶液，检体仍着色时，再以含1%醋酸之70%乙醇溶液一次或数次反复浸出，合并浸出液，以10%氨水溶液中和，蒸发去除乙醇，加去离子水至原容量作为试验溶液。
2.1.3.2.3.    果冻、果酱、味噌及馅等食品：
         　　      检体加入约3〜5倍量之热去离子水，混合放置后以玻璃棉或石棉过滤，取滤液作为试验溶液，色素无法抽出时，应按照 2.1.3.2.2.节之方法调制。
2.1.3.2.4.    巧克力、可可及奶油等制品：
         　　      将检体置于大型滤纸上或装入烧杯，以乙醚经数次洗涤脱脂，检体上残留之乙醚以干燥滤纸吸附或使之自然风干，再依 2.1.3.2.2.节之方法调制试验溶液。
2.1.3.2.5.    谷类制品：
         　　      检体加入约5倍量之80%乙醇溶液，放置24小时并时时振摇，静置后取浸出液于水浴上蒸发浓缩至原容量1/5，再加入约1/4容量之25%氯化钠溶液，并加10%氨水溶液使呈碱性，移入分液漏斗中，用同量之石油醚振摇脱脂数次后，取下层液以6%醋酸溶液中和，作为试验溶液。石油醚层着色时，应以6%醋酸溶液混合振摇萃取，取出醋酸层中和后，并入前项试验溶液。
2.1.3.2.6.    口香糖类：
         　　      检体加入约5倍量之去离子水煮沸，冷却过滤后，取着色滤液作为试验溶液，检体仍着色或滤液未着色时，添加10%氨水溶液使呈中性或微碱性，再煮沸，冷却过滤后，取滤液并入前项试验溶液。
2.1.3.3. 水产及畜产食品：
       　　依着色程度称取检体20〜 200 g ，依 2.1.3.2.4.节之方法调制试验溶液。
2.2. 毛线染色分离鉴别法
2.2.1. 滤纸层析法（Paper chromatography）
2.2.1.1. 装置：
2.2.1.1.1.    展开槽。
2.2.1.1.2.    紫外灯：波长254 nm及365 nm（或375 nm）。
2.2.1.2. 试药：醋酸、氨水（25%）、正丁醇、乙醇、丙酮及异戊醇均采用试药级；去离子水（比电阻于 25℃ 可达 18 M W‧cm以上）；食用红色六号（New Coccine）、食用红色七号（Erythrosin）、食用黄色四号（Tartrazine）、食用黄色五号（Sunset Yellow FCF）、食用蓝色一号（Brilliant Blue FCF）、食用蓝色二号（Indigo Carmine）、食用绿色三号（Fast Green FCF）及食用红色四十号（Allura Red AC）对照用标准品。
2.2.1.3. 器具及材料：
2.2.1.3.1.    滤纸：层析用滤纸。
2.2.1.3.2.    毛细管或微量吸管。
2.2.1.3.3.    容量瓶：100 mL。
2.2.1.3.4.    分液漏斗。
2.2.1.3.5.    烧杯。
2.2.1.3.6.    毛线：应选用脱脂且不含荧光物质之未着色纯毛毛线，否则应按下列步骤处理。
　　　　　(1) 脱脂：利用索式（Soxhlet）抽出器，以石油醚将毛线充分脱脂后，取出毛线，于室温下去除石油醚，以去离子水充分冲洗后，轻轻榨压后风干。
　　　　　(2) 脱荧光物质：取脱脂毛线 10 g ，置于烧杯中，加氨水1〜4 mL，并加适量去离子水浸淹，而后置于 45℃ 水浴中温浸30〜60分钟时时搅拌。取出毛线后，再置入稀氨水溶液中，充分搅拌。再取出毛线，先用温去离子水，次用冷去离子水充分冲洗，轻轻榨压后风干。
2.2.1.4. 试剂之调制：
2.2.1.4.1.    稀氨水溶液：
         　　取氨水1 mL，加去离子水使成100 mL。
2.2.1.4.2.    1N醋酸溶液：
         　　取醋酸 6 g ，加去离子水使成100 mL。
2.2.1.4.3.    0.5N醋酸溶液：
         　　1N醋酸溶液以去离子水稀释2倍。
2.2.1.4.4.    5%氨水溶液：
         　　取氨水20 mL，加去离子水使成100 mL。
2.2.1.4.5.    1%氨水溶液：
         　　5%氨水溶液以去离子水稀释5倍。
2.2.1.4.6.    10%醋酸溶液：
         　　取醋酸10 mL，加去离子水使成100 mL。
2.2.1.4.7.    0.5N氨水溶液：
         　　取氨水7 mL，加去离子水使成100 mL。
2.2.1.4.8.    25%乙醇溶液：
         　　取乙醇与去离子水，以25：75（v/v）之比例混匀。
2.2.1.5. 展开溶媒：
(1)   正丁醇：乙醇：0.5N氨水溶液（6:2:3, v/v/v）。
(2)   正丁醇：乙醇：0.5N醋酸溶液（6:2:3, v/v/v）。
(3)   丙酮：异戊醇：去离子水（6:5:5, v/v/v）。
(4)   25%乙醇溶液：5%氨水溶液（1:1, v/v）。
2.2.1.6. 标准溶液之配制：
       　　     取食用红色六号等8项对照用标准品各约100 mg，精确称定，共置于 100 m L容量瓶中，以去离子水溶解并定容，使其浓度为0.1%，供作标准溶液。
2.2.1.7. 检液之调制：
       　　     依着色浓度取试验溶液5〜20 mL，置于烧杯中，加1N醋酸溶液 1 m L使呈酸性后，投入毛线 0.1 g ，搅拌后置于水浴上加热30分钟。取出已着色之毛线，以水充分冲洗后，将毛线移入另一烧杯中，加1%氨水溶液5 mL，于水浴上加热30分钟，使色素溶出后，去除毛线，加入10%醋酸溶液2 mL，使呈酸性，再投入新毛线 0.1 g 搅拌，置于水浴上加热30分钟，毛线着色时，即有酸性色素存在。取出着色毛线，依前述操作加入1%氨水溶液，使色素溶出，并浓缩至约0.5 mL，供作检液。
2.2.1.8. 鉴别试验：
       　　     取滤纸于其下端约2〜4 cm处用铅笔画一横线，沿横线每隔1.5〜 2 c m处，以毛细管或微量吸管依次分别点上直径约 0.5 c m圆点之各检液及标准溶液并风干之。而后置入盛有展开溶媒之展开槽内，滤纸需垂直，且不得碰到槽壁，使展开溶媒浸没滤纸下端约 1 c m处，密盖之。展开溶媒浸润上升至约13〜 25 c m处，取出风干，依检液上升之斑点的位置和颜色与标准溶液比较鉴别之。必要时得于紫外灯照射下观察，作进一步鉴定。
2.2.2. 薄层层析法（Thin layer chromatography）
2.2.2.1. 装置：
2.2.2.1.1.    展开槽。
2.2.2.1.2.    紫外灯：同2.2.1.1.2.节。
2.2.2.2. 试药：醋酸、氨水（25%）、醋酸乙酯、乙醇、正戊醇、丁酮（methyl ethyl ketone）、2-甲氧基乙醇（ethylene glycol monomethyl ether）、甲醇及异戊醇均采用试药级；去离子水（比电阻于 25℃ 可达 18 M W‧cm以上）；食用红色六号（New Coccine）等同2.2.1.2.节之8项对照用标准品。
2.2.2.3. 器具及材料：
2.2.2.3.1.    毛细管或微量吸管。
2.2.2.3.2.    分液漏斗。
2.2.2.3.3.    毛线：同2.2.1.3.6.节
2.2.2.3.4.    薄层层析板：硅胶，厚度 0.2 mm ，20 × 20 cm 。
2.2.2.4. 试剂之调制：
2.2.2.4.1.    1N醋酸溶液：同2.2.1.4.2.节。
2.2.2.4.2.    1%氨水溶液：同2.2.1.4.5.节。
2.2.2.4.3.    10%醋酸溶液：同2.2.1.4.6.节。
2.2.2.5. 展开溶媒：
(1)   醋酸乙酯：甲醇：氨水（4:5:1或3:1:1, v/v/v）。
(2)   正戊醇：乙醇：氨水（10:10:1, v/v/v）。
(3)   丁酮：2-甲氧基乙醇：乙醇：氨水（20:15:12:1, v/v/v/v）。
(4)   甲醇：乙醇：异戊醇：氨水（15:10:5:3, v/v/v/v）。
2.2.2.6. 标准溶液之配制：同2.2.1.6.节。
2.2.2.7. 检液之调制：同2.2.1.7.节。
2.2.2.8. 鉴别试验：
       　　     沿硅胶薄层板下端 2 c m 之横向，每隔 1 c m 分别点上直径约 0.3 c m 之检液及标准溶液，并风干之。而后置入盛有展开溶媒之展开槽内，使展开溶媒浸没薄层板下端0.5〜 1 cm ，展开高度达8〜 15 c m 后取出风干，依检液上升之斑点的位置及颜色与标准溶液比较鉴别之，必要时得于紫外灯照射下观察，作进一步鉴定。
2.2.3. 高效液相层析法（High performance liquid chromatography）
2.2.3.1. 装置：
2.2.3.1.1.    高效液相层析仪：
2.2.3.1.1.1. 检出器：光二极管数组检出器（photodiode array detector）。
2.2.3.1.1.2. 层析管：Atlantis T3，3 μm，内径 2.1 mm × 10 cm ，或同级品。
2.2.3.2. 试药：醋酸及氨水（25%）均采用试药级；磷酸（85%）、磷酸氢二铵（diammonium hydrogen phosphate）及磷酸二氢铵（ammonium dihydrogen phosphate）均采用试药特级；甲醇采用液相层析级；去离子水（比电阻于 25℃ 可达 18 M W‧cm以上）；食用红色六号（New Coccine）等同2.2.1.2.节之8项对照用标准品。
2.2.3.3. 器具及材料：
2.2.3.3.1.    容量瓶：100 mL及1000 mL。
2.2.3.3.2.    濾膜：孔径0.45 μm，Nylon材质。
2.2.3.4. 试剂之调制：
2.2.3.4.1.    1N醋酸溶液：同2.2.1.4.2.节。
2.2.3.4.2.    1%氨水溶液：同2.2.1.4.5.节。
2.2.3.4.3.    10%醋酸溶液：同2.2.1.4.6.节。
2.2.3.4.4.    1M磷酸溶液：
         　　取磷酸67.4 mL，加去离子水使成1000 mL。
2.2.3.5. 移动相溶液之调制：
2.2.3.5.1.    移动相溶液A：
         　　       称取磷酸二氢铵 1.15 g 及磷酸氢二铵 1.32 g ，以去离子水溶解使成1000 mL，以 1M 磷酸溶液调整pH值至6.0，以滤膜过滤，取滤液供作移动相溶液A。
2.2.3.5.2.    移动相溶液B：甲醇。
2.2.3.6. 标准溶液之配制：
       　　     取食用红色六号等8种对照用标准品各约100 mg，精确称定，共置于 100 m L容量瓶中，以去离子水溶解并定容，作为标准原液。临用时以去离子水稀释至10 μg/mL，供作标准溶液。
2.2.3.7. 检液之调制：
       　　依 2.2.1.7.节调制之溶液，以滤膜过滤后，供作检液。
2.2.3.8. 鉴别试验：
       　　     精确量取检液及标准溶液各10 μL，分别注入高效液相层析仪中，依下列条件进行液相层析，就检液与标准溶液所得波峰之滞留时间及吸收图谱比较鉴别之。
       　　 高效液相层析测定条件：
       　　　　 光二极管数组检出器：波长254 nm。
       　　　　 层析管：Atlantis T3，3 μm，内径 2.1 mm × 10 cm 。
       　　　　 层析管温度： 30℃ 。
       　　　　 移动相溶液：A液与B液以下列条件进行梯度分析

时间（min）
A（%）
B（%）

0 → 4
90 → 50
10 → 50

4 → 8
50 → 40
50 → 60

8 → 12
40 → 20
60 → 80

12 → 12.1
20 → 90
80 → 10

12.1 → 15
90 → 90
10 → 10

       　　　　 移动相流速： 0.7 m L/min。
附注：
1.  食品中有影响检验结果之物质时，应自行探讨。
2.  以液相层析串聯质谱仪（LC/MS/MS）进行确认时，其多重反应侦测（multiple reaction monitoring, MRM）模式参考参数如附表。
　附表：食用红色六号等8项着色剂之液相层析串联质谱仪多重反应侦测模式参数
厦门WTO工作站编
2012.11.20