台湾地区制定食品中防腐剂检验方法，2012年11月19日生效2012年11月19日，台湾地区“行政院”卫生署发布署授食字第1011903320号公告，制定“食品中防腐剂之检验方法”，自即日生效。
食品中防腐剂之检验方法
1.  适用范围：本检验方法适用于食品中酸类防腐剂[苯甲酸（benzoic acid）、己二烯酸（sorbic acid）、去水醋酸（dehydroacetic acid）、对羟苯甲酸（p-hydroxybenzoic acid）、水杨酸（salicylic acid）]及酯类防腐剂[对羟苯甲酸甲酯（methyl p-hydroxybenzoate）、对羟苯甲酸乙酯（ethyl p-hydroxybenzoate）、对羟苯甲酸异丙酯（isopropyl p-hydroxybenzoate）、对羟苯甲酸丙酯（propyl p-hydroxybenzoate）、对羟苯甲酸第二丁酯（secbutyl p-hydroxybenzoate）、对羟苯甲酸异丁酯（isobutyl p-hydroxybenzoate）及对羟苯甲酸丁酯（butyl p-hydroxybenzoate）]之检验。
2.  检验方法：检体经直接稀释或振荡萃取或水蒸气蒸馏后，以高效液相层析仪（high performance liquid chromatograph, HPLC）分析之方法。
2.1. 装置：
2.1.1. 高效液相层析仪：
2.1.1.1. 检出器：光二极管数组检出器（photodiode array detector）。
2.1.1.2. 层析管：ACE C18-AR，5 μm，内径 4.6 mm × 25 cm ，或同级品。
2.1.2. 離心机（Centrifuge）：转速可达3500 rpm者。
2.1.3. 超音波振荡器（Ultrasonicator）。
2.1.4. 蒸馏装置（Distillation apparatus）。
2.2. 试药：氢氧化钠、柠檬酸（C6H8O7．H2O）、柠檬酸三钠（Na 3C 6H5O7．2H2O）及酒石酸均采用试药特级；氯化钠采试药级；甲醇及乙腈均采用液相层析级；去离子水（比电阻于 25℃ 可达 18 M W‧cm以上）；苯甲酸、己二烯酸、去水醋酸、对羟苯甲酸、水杨酸、对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸乙酯、对羟苯甲酸异丙酯、对羟苯甲酸丙酯、对羟苯甲酸第二丁酯、对羟苯甲酸异丁酯及对羟苯甲酸丁酯对照用标准品。
2.3. 器具及材料：
2.3.1. 蒸馏瓶：500 mL。
2.3.2. 離心管：50 mL，PP材质。
2.3.3. 容量瓶：50 mL、100 mL、200 mL、500 mL及1000 mL。
2.3.4. 濾膜：孔径0.45 μm，Nylon 材质。
2.4. 试剂之调制：
2.4.1. 50%甲醇溶液：
      　　取甲醇及去离子水，以1：1（v/v）之比例混匀。
2.4.2. 0.1N氢氧化钠溶液：
      　　称取氢氧化钠 0.4 g ，以去离子水溶解使成100 mL。
2.4.3. 5 mM柠檬酸缓冲溶液：
      　　称取柠檬酸 7.0 g 及柠檬酸三钠 6.0 g ，以去离子水溶解使成1000 mL。临用时再以去离子水稀释10倍，以滤膜过滤。
2.4.4. 15%酒石酸溶液：
      　　称取酒石酸 15 g ，以去离子水溶解使成100 mL。
2.5. 移动相溶液之调制：
2.5.1. 移动相溶液A： 5 mM 柠檬酸缓冲溶液。
2.5.2. 移动相溶液B：
      　　取甲醇与乙腈以1：2（v/v）之比例混匀后，以滤膜过滤，取滤液供作移动相溶液B。
2.5.3. 移动相溶液C：
      　　取甲醇、乙腈及 5 m M柠檬酸缓冲溶液以1：2：7（v/v/v）之比例混匀后，以滤膜过滤，取滤液供作移动相溶液C。
2.5.4. 移动相溶液D：
      　　取甲醇及 5 m M柠檬酸缓冲溶液以6：4（v/v）之比例混匀后，以滤膜过滤，取滤液供作移动相溶液D。
2.6. 标准溶液之配制：
    　　   取苯甲酸、己二烯酸、去水醋酸、对羟苯甲酸及水杨酸对照用标准品各约50 mg，精确称定，分别置于 100 m L容量瓶中，以0.1N氢氧化钠溶液 5 m L溶解后，加去离子水定容，作为酸类防腐剂标准原液；取对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸乙酯、对羟苯甲酸异丙酯、对羟苯甲酸丙酯、对羟苯甲酸第二丁酯、对羟苯甲酸异丁酯及对羟苯甲酸丁酯对照用标准品各约50 mg，精确称定，分别置于 100 m L容量瓶中，以50%甲醇溶液溶解并定容，作为酯类防腐剂标准原液。临用时各取适量标准原液混合，以50%甲醇溶液稀释至0.25～100 μg/mL，供作标准溶液。
2.7. 检液之调制：
2.7.1. 稀释法（适用液体检体）：
      　　   含二氧化碳之检体应先去除二氧化碳，取检体约 5 g ，精确称定，以50%甲醇溶液定容至100 mL，混匀后，静置10分钟，经滤膜过滤，取滤液供作检液。
2.7.2. 萃取法：
      　　   将检体均质混匀后，取约 5 g ，精确称定，加入50%甲醇溶液50 mL，经超音波振荡30分钟后，以50%甲醇溶液定容至100 mL，取试量萃取液，于3500 rpm离心10分钟，取上清液经滤膜过滤后，取滤液供作检液。
2.7.3. 水蒸气蒸馏法：
      　　   将检体均质混匀后，取约 25 g ，精确称定，置于蒸馏瓶中，加入15%酒石酸溶液 1 5 m L、氯化钠 60 g 及去离子水150 mL，以水蒸气蒸馏之，以每分钟约 10 m L之速度收集馏出液约490 mL，以去离子水定容至500 mL，经滤膜过滤后，取滤液供作检液。
2.8. 鉴别试验及含量测定：
    　　   精确量取检液及标准溶液各10 μL，分别注入高效液相层析仪中，依下列条件进行液相层析，就检液与标准溶液所得波峰之滞留时间及吸收图谱比较鉴别之，并依下列计算式求出检体中各防腐剂之含量（g/kg）：
    　　　　 检体中各防腐剂之含量（g/kg）＝
    　　C：由标准曲线求得检液中各防腐剂之浓度（μg/mL）
    　　V：检体最后定容之体积（mL）
    　　M：取样分析检体之重量（g）
    　　F：换算值（注）
     注：检体检出酯类防腐剂时，以对羟苯甲酸含量计，其换算值如下表：

酯类防腐剂
分子量
对羟苯甲酸之换算值

对羟苯甲酸甲酯
152.15
0.9077

对羟苯甲酸乙酯
166.17
0.8311

对羟苯甲酸异丙酯
180.20
0.7664

对羟苯甲酸丙酯
180.20
0.7664

对羟苯甲酸第二丁酯
194.23
0.7111

对羟苯甲酸异丁酯
194.23
0.7111

对羟苯甲酸丁酯
194.23
0.7111

对羟苯甲酸
138.12
1

 
    　　高效液相层析测定条件：
    　　　　层析管：ACE C18-AR，5 μm，内径 4.6 mm × 25 cm 。
    　　　　移动相流速： 1 m L/min。
    　　　　层析测定条件1：
　　　　　　　　光二极管数组检出器：   波长230 nm（水杨酸、苯甲酸及去水醋酸）、256 nm（对羟苯甲酸及其酯类）及260 nm（己二烯酸）。
　　　　　　　　移动相溶液：A液与B液以下列条件进行梯度分析

时间（min）
A（%）
B（%）

0 → 5
78 → 73
22 → 27

5 → 20
73 → 63
27 → 37

20 → 50
63 → 33
37 → 67

50 → 65
33 → 78
67 → 22

 
    　　　　层析测定条件2：
　　　　　　　　光二极管数组检出器：   波长230 nm（水杨酸、苯甲酸及去水醋酸）、256 nm（对羟苯甲酸）及260 nm（己二烯酸）。
    　　　　　　移动相溶液：C液。
    　　　　层析测定条件3：
    　　　　　　光二极管数组检出器：波长256 nm（对羟苯甲酸酯类）。
    　　　　　　移动相溶液：D液。
 附注：
1.  本检验方法酸类防腐剂之定量极限均为 0.02 g /kg；酯类防腐剂之定量极限均为 0.005 g /kg。
2.  采稀释法或萃取法均不可行时，可采水蒸气蒸馏法，惟该法仅适用于酸类防腐剂之分析。
3.  食品中有影响检验结果之物质时，应自行探讨。
4.  以液相层析串聯质谱仪（LC/MS/MS）进行确认时，其LC/MS/MS之多重反应侦测（multiple reaction monitoring, MRM）模式参考参数如附表。
附表：苯甲酸等12项防腐剂之液相层析串联质谱仪多重反应侦测模式参数
厦门WTO工作站编
2012.11.20