台湾地区制定冷藏与冷冻解冻鸡肉酵素活性检验方法，自2014年1月21日生效2014年1月21日，台湾地区“行政院农业委员会”发布农牧字第1030042053 号公告，：订定“冷藏与冷冻解冻鸡肉酵素活性检验方法”，并自即日起生效。
冷藏与冷冻解冻鸡肉酵素活性检验方法
1、适用范围：适用于判定块状冷藏与冷冻解冻鸡肉。
2、原理：冻结处理会破坏肌肉细胞的粒线体，解冻时粒线体中的酵素会释放至肌浆中，因此测定肌浆中粒线体β-羟基酰辅酶A去氢酶（β-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，HADH）的活性，即可了解鸡肉是否经过冷冻处理。
3、 仪器设备与药品
3.1 试药
3.1.1 磷酸氢二钾（K2HPO4）：试药级。
3.1.2 磷酸二氢钾（KH2PO4）：试药级。
3.1.3 Ethylene-dianitrilo-tetra-acetic acid（EDTA）：试药级。
3.1.4 还原型烟碱酰胺腺嘌呤双核苷酸（β-NADH Sigma-Aldrich）：对照用标准品。
3.1.5 乙酸乙酰基辅酶A（Acetoacetyl-CoA Sodium，Sigma-Aldrich）：对照用标准品。
3.2 去离子水：比电阻于25℃可达18ΜΩ.cm 以上。
3.3 仪器设备及器材
3.3.1 分光光度计：波长340nm。
3.3.2 榨肉汁器：2 块厚1.5cm 的压克力板，榨取肉汁。
3.3.3 利刃。
3.3.4 塑料培养皿。
3.3.5 漏斗。
3.3.6 滤纸：Whatman No.2。
3.3.7 定量瓶：25 mL。
3.3.8 塑料试管：5 mL。
3.3.9 塑料离心管：50 mL。
3.3.10 石英管：3 mL，1 cm × 1 cm 管径。
3.4 试剂配制
3.4.1 0.1M 磷酸缓冲液（pH 6.0）：秤取K2HPO4 17.4g 及KH2PO4 13.6g，分别以蒸馏水溶成1 L 后，混合兩种溶液调整至pH 6.0，置于4℃冰箱备用。
3.4.2 26.9 mM EDTA 溶液：100 mg EDTA 溶于10 mL 蒸馏水后冷藏备用。
3.4.3 7.1 mM 还原型烟碱酰胺腺嘌呤双核苷酸（β-NADH，SIGMA-ALDRICH）溶液：5 mg NADH 溶于1 mL 蒸馏水冷藏备用。
3.4.4 5.9 mM乙酸乙酰基辅酶A（Acetoacetyl-CoA Sodium，SIGMA-ALDRICH）溶液：25 mg的Acetoacetyl CoA 溶于5 mL 蒸馏水后冷藏备用。
4、 操作流程
4.1 肉汁制备
4.1.1 冷冻块狀鸡肉于试验前24 小时取出置于4℃冷藏柜中解冻，以利刃取下约2-3 g 肉（1.5×1.5 cm），切口表面以0.1M 磷酸缓冲液冲洗，再以纸巾擦干表面。
4.1.2 将肉放在两块厚约1.5 cm 的压克力板间，旋紧螺丝以榨取肉汁，并以塑料培养皿收集肉汁。
4.1.3 肉汁以0.1 M 磷酸缓冲溶液稀释200 倍，并经滤纸（Whatman No.2）过滤后备用。
4.2 酵素活性测定步骤
4.2.1 取2.6 mL 0.1 M 磷酸缓冲溶液加入1 cm × 1 cm 管径的石英管中。
4.2.2 加入0.2 mL 26.9 mM 的EDTA 溶液。
4.2.3 加入0.05 mL 7.1 mM 的β-NADH 溶液。
4.2.4 加入0.1 mL 稀释200 倍的肉汁后混合均匀；对照组加入0.1 mL 去离子水。
4.2.5 加入0.05 mL 5.9 mM的Acetoacetyl-CoA，立刻混匀并置入分光光度计（Spectrophotometer，SHIMADZU，UV-1800 型；Beckman Coulter，DU 700），以波长340 nm 测定反应0、1、2 及3 分钟的吸光值（O.D.），扣除对照组的吸光值后，计算每分钟NADH 的降解速率（△E/min）。
5、 HADH 酵素活性的计算
Units /mL enzyme =（△E/min × 3 ×肉汁稀释倍數）／（6.3 × 0.1）
△E/min：平均每分钟吸光值的差值
3：石英管中混合液的总体积（mL）
6.3：在波长340 nm 下β-NADH 消失系数
0.1：添加稀释肉汁mL数
备注： 判定标准以HADH 酵素活性5.5 Unit/mL 为界，当测值低于5.5 Unit/mL 以下者，可判定样品为冷藏鸡肉；测值高于5.5 Unit/mL 以上者，可判定鸡肉为经过冷冻处理。
厦门WTO工作站编
2014.1.22