台湾地区拟制定食品中氯霉素类抗生素残留量的检验方法2014年3月13日，台湾地区“卫生福利部”发布部授食字第1031900266号公告，预告制定“食品中动物用药残留量检验方法－氯霉素类抗生素之检验”草案，20日内接收公众意见或建议。
食品中动物用药残留量检验方法－氯霉素类抗生素之检验草案
1.  适用范围：本检验方法适用于农畜禽水产品之肌肉、蛋类、内脏、乳汁及蜂蜜中氯霉素（chloramphenicol）、甲磺氯霉素（thiamphenicol）、氟甲磺氯霉素（florfenicol）及氟甲磺氯霉素胺（florfenicol amine）之检验。
2.  检验方法：检体经萃取及净化后，以液相层析串联质谱仪（liquid chromatograph/tandem mass spectrometer, LC/MS/MS）分析之方法。
2.1. 装置：
2.1.1. 液相层析串联质谱仪：
2.1.1.1. 离子源：电洒离子化（electrospray ionization, ESI）。
2.1.1.2. 层析管：XSELECT HSS PFP，2.5 μm，内径 2.1 mm × 10 cm ，或同级品。
2.1.2. 离心机（Centrifuge）：可达3200 × g以上者。
2.1.3. 振荡器（Shaker）。
2.1.4. 均质机（Homogenizer）。
2.1.5. 氮气蒸发装置（Nitrogen evaporator）。
2.1.6. 固相真空萃取装置（Solid phase extraction vacuum manifolds）。
2.1.7. 旋涡混合器（Vortex mixer）。
2.2. 试药：甲酸与甲醇均采用液相层析级；正己烷、乙酸乙酯、氨水（30%）、三氯醋酸（trichloroacetic acid）及醋酸均采用试药特级；去离子水（比电阻于 25℃ 可达 18 MΩ/cm以上）；氯霉素、甲磺氯霉素、氟甲磺氯霉素及氟甲磺氯霉素胺对照用标准品；chloramphenicol-d5、thiamphenicol-d3、florfenicol-d3及florfenicol amine-d3同位素内部标准品。
2.3. 器具及材料：
2.3.1. 容量瓶：1 mL及100 mL。
2.3.2. 离心管：50 mL，PP材质。
2.3.3. 固相萃取匣（Solid phase extraction cartridge）：Oasis MCX，6 mL，150 mg，或同级品。
2.3.4. 滤膜：孔径0.22 μm，PVDF材质。
2.4. 试剂调制
2.4.1. 50%甲醇溶液：
      　　取甲醇50 mL，加去离子水使成100 mL。
2.4.2. 5%醋酸溶液：
      　　取醋酸5 mL，加去离子水使成100 mL。
2.4.3. 5%三氯醋酸溶液：
      　　称取三氯醋酸50 g，以去离子水溶解使成1000 mL。
2.4.4. 含0.6%氨水之乙酸乙酯溶液：
      　　取氨水20 mL，加乙酸乙酯使成1000 mL。
2.4.5. 含3%氨水之甲醇溶液：
      　　取氨水10 mL，加甲醇使成100 mL。
2.4.6. 25%甲醇溶液：
      　　取甲醇25 mL，加去离子水使成100 mL。
2.5. 移动相溶液之调制：
2.5.1. 移动相溶液A：
      　　取甲酸1 mL，加去离子水使成1000 mL，以滤膜过滤，取滤液供作移动相溶液A。
2.5.2. 移动相溶液B：甲醇。
2.6. 标准溶液之配制：
    　　   取氯霉素、甲磺氯霉素、氟甲磺氯霉素及氟甲磺氯霉素胺对照用标准品各约10 mg，精确称定，分别以50%甲醇溶液溶解并定容至100 mL，作为标准原液，于 -20℃ 贮存。临用时分别取适量各标准原液混合，以50%甲醇溶液稀释至0.003～2.5 mg/mL，供作标准溶液。
2.7. 内部标准溶液之配制：
    　　   取chloramphenicol-d5、thiamphenicol-d3、florfenicol-d3及florfenicol amine-d3同位素内部标准品各约10 mg，精确称定，共置于100 mL容量瓶中，以50%甲醇溶液溶解并定容，供作内部标准溶液，于 -20℃ 贮存。
2.8. 检液之调制：
2.8.1. 萃取：
2.8.1.1. 肌肉：
       　　    将检体细切均质后，取约5 g，精确称定，置于离心管中，加入内部标准溶液50 mL及含0.6%氨水之乙酸乙酯溶液20 mL，旋涡混合1分钟，振荡10分钟，以3200×g离心10分钟，取上清液。加入5%醋酸溶液2 mL，旋涡混合1分钟，取下层液，于45℃水浴中以氮气浓缩至约2 mL，加入5%醋酸溶液4 mL，旋涡混合后，供净化用。
2.8.1.2. 蛋与内脏：
       　　    将检体混匀后，取约5 g，精确称定，置于离心管中，加入内部标准溶液50 mL及5%三氯醋酸溶液20 mL，旋涡混合1分钟，振荡10分钟，以3200×g离心10分钟，取上清液，加入正己烷20 mL，旋涡混合1分钟，以3200×g离心5分钟，取下层液供净化用。
2.8.1.3. 乳汁：
       　　    将检体混匀后，精确量取5 mL，置于离心管中，加入内部标准溶液50 mL及5%三氯醋酸溶液20 mL，旋涡混合1分钟，振荡10分钟，以3200×g离心10分钟，取上清液供净化用。
2.8.1.4. 蜂蜜：
       　    　将检体混匀后，取约5 g，精确称定，置于离心管中，加入内部标准溶液50 mL及5%醋酸溶液10 mL，旋涡混合1分钟，振荡10分钟，供净化用。
2.8.2. 净化：
      　    　取2.8.1.节供净化用溶液，注入预先以甲醇5 mL及去离子水 5 m L润洗之固相萃取匣，弃流出液，以5%醋酸溶液5 mL流洗，弃流出液，再以含3%氨水之甲醇溶液5 mL冲提，收集冲提液，于45℃水浴中以氮气浓缩至干，再以25%甲醇溶液定容至1 mL，经滤膜过滤后，供作检液。
2.9. 基质匹配检量线之制作：
    　　   取空白检体，不添加内部标准溶液，依2.8.节萃取、净化及以氮气浓缩至干后，分别添加不同浓度标准溶液0.5 mL及内部标准溶液50 mL，再以去离子水定容至1 mL，经滤膜过滤后，依下列条件进行液相层析串联质谱分析。就各氯霉素类抗生素与内部标准品之波峰面积比，与对应之各氯霉素类抗生素浓度，制作基质匹配检量线。
    　　   液相层析串联质谱测定条件（注）：
    　　　　   层析管：XSELECT HSS PFP，2.5 μm，内径2.1 mm × 10 cm。
    　　　　   移动相溶液：A液与B液以下列条件进行梯度分析 

时间（min） 
A（%） 
B（%） 

0.0 → 1.0
95 → 95
0.0 → 5

1.0 → 2.0
95 → 85
0.0 → 15

2.0 → 5.0
85 → 30
0.0 → 70

5.0 → 10.0
30 → 20
0.0 → 80

10.0 → 10.1
20 → 95
80 → 5

10.1 → 15.0
95 → 95
5 → 5

移动相流速：0.3 mL/min。 
    　　　　注入量：10 μL。 
    　　　　离子喷洒电压（Ion spray voltage）：5.5 kV (ESI+)，-4.5 kV (ESI-)。 
    　　　　溶媒挥散温度（Desolvation temperature）： 550℃ 。 
    　　　　气簾气体（Curtain gas）：20 psi。 
    　　　　雾化气体（Ion source gas 1）：50 psi。 
    　　　　加热气体（Ion source gas 2）：50 psi。 
　　　　　　侦测模式：多重反应侦测（multiple reaction monitoring, MRM）。侦测离子对、去集簇电压（declustering potential）与碰撞能量（collision energy）如下表： 

分析物 
离子化 
模式 
离子对 
去集簇电压 
（V） 
碰撞能量 
（eV） 

前驱離子（m/z）＞ 
产物離子（m/z） 

氯霉素 
ESI-
321 > 152*
321 > 257
-65
-65
-22
-14

甲磺氯霉素 
ESI-
354 > 185*
354 > 290
-73
-73
-26
-16

氟甲磺氯霉素 
ESI-
356 > 336*
356 > 185
-73
-73
-12
-26

氟甲磺氯霉素胺 
ESI+
248 > 230*
248 > 130
46
46
13
33

Chloramphenicol-d5 (I.S.)
ESI-
326 > 157
-65
-22

Thiamphenicol-d3 (I.S.)
ESI-
357 > 188
-73
-26

Florfenicol-d3 (I.S.)
ESI-
361 > 341
-73
-12

Florfenicol amine-d3 (I.S.)
ESI+
251 > 233
46
17

    　　　　*定量离子对
     注：上述测定条件分析不适时，可依所使用之仪器，设定适合之测定条件。 
2.10.    鉴别试验及含量测定：
    　　   精确量取检液及标准溶液各10 μL，分别注入液相层析串联质谱仪中，依2.9.节条件进行分析。就检液与标准溶液所得波峰之滞留时间及多重反应侦测相对离子强度（注）鉴别之，并依下列计算式求出检体中各氯霉素类抗生素之含量（ppm）：
                          
    　　    C：由基质匹配检量线求得检液中各氯霉素类抗生素之浓度（μg/mL）
    　　    V：检体最后定容之体积（mL）
    　　    M：取样分析检体之重量（g）或体积（mL）
　　注：相对离子强度由定性离子对与定量离子对之波峰面积比而得（≦100%），容许范围如下：

相对离子强度（%）
容许范围（%）

＞50
±20

＞20～50
±25

＞10～20
±30

≦10
±50

 
附注：1.   本检验方法之定量极限，氯霉素均为0.0003 ppm，甲磺氯霉素、氟甲磺氯霉素及氟甲磺氯霉素胺均为0.005 ppm。
　　　2.   食品中有影响检验结果之物质时，应自行探讨。
 
厦门WTO工作站编
2014.3.14